十五、新选组进退存亡
实际上近藤与土方留这四名长州人在队中的真正目的，是想借此四人顺藤摸瓜，将京都市中暗藏的长州激进浪士一网打尽。九月二十六日晨，永仓与中村回到了屯所，立刻向近藤报告了昨夜所发生之变故。近藤一听，这四名长州人竟然已经开始行动，便向永仓下达指令：即刻带人除掉这四名长州叛徒！
永仓新八被这几个长州人盯了一夜，心里早就窝着一股火，马上连同斋藤一、林信太郎来到新选组的另一处屯所——前川司邸，首先盯上了住在那里的御仓伊势武和荒木田左马之助。
三人来到缘侧，见那两个不知大限已至的长州人还坐在那里互相剃头。斋藤绕到御仓的后方，林信太郎绕到荒木后方，两人几乎同时拔刀，电光石火般的速度将御仓、荒木砍倒。这两人手搭在刀柄处，刀都没来得及拔出来就当场被刺死。
与此同时，冲田与藤堂从别间破门而入。越后三郎跟松井龙次郎二人先知先觉，一看情势有变，赶忙跳窗逃跑。
冲田也不忙着追赶，把大刀一挥，冲着屋内大喊，“里面还有他们的同伴，别让他们跑了！”
这冲田总司看来在近藤影响下也是研究过孙子兵法，敲山震虎这招确实管用，松永主计、楠小十郎二人听到这一句，当即吓得魂飞魄散自乱阵脚，打开房门仓皇出逃。井上源三郎马上朝着松永主计逃跑方向狂追。但这松永心里清楚，要是被追上那就只有死路一条。人在生死关头潜力就无限地被激发出来，这松永拼命地狂奔，井上追在后面却始终隔着一小段距离。随着体力的逐渐消耗，一向性格温和的井上也开始被激怒，烦燥之下拔刀冲着松永的后背便砍，可惜这松永运气太好，这一刀只在他背后砍了一个竖着的“一”字，并未给予致命伤害。而井上也终于体力不支，眼睁睁看着松永像兔子一般蹦跳着逃走了。
另一边，楠小十郎就没这么好运气了。这楠小十郎年仅十七岁，相貌之俊美不亚于佐佐木爱次郎。在四名长州间谍入队之前就已经受了桂小五郎的密令潜入新选组，在此期间还曾密访真木和泉，暗中进行间谍活动。桂小五郎大概也是寄希望于楠小十郎的“美貌”之上，希望近藤或土方能给予楠特殊关注，以便多掌握些新选组秘密情报。但可惜，无论是近藤还是土方都未曾信任过楠，更不曾给予过任何的“特殊关注”。
原田左之助一见楠小十郎逃跑，立刻自告奋勇冲出去便追，这原田也是新选组中有名的飞毛腿，瞬间爆发力是非同凡响，真正是以“飞一般的速度”追在楠的身后，不大一会就在屯所外的菜田里将楠捉住。楠小十郎毕竟年轻，出于对死亡的恐怖，被原田捉住后不停的哭叫哀嚎，各种挣扎不配合。原田左之助其人脾气是相当的火爆，一见楠小十郎的这种丢人行径立刻火冒三丈，抽出腰刀寒光一闪，楠小十郎的脑袋和身子就分家了。
于是桂小五郎精心策划的间谍计划就被迫中止了。
十二月二十七日，随着前芹泽党的最后一人——野口健司的切腹，彻底地为芹泽政权划下了休止符。次日，野口被葬在壬生寺不远处的光缘寺。此时队内人数约六十人。
元治元年一月二日，德川家茂再次出发从海路经由大阪，然后抵达京都。此行的目的很简单，就是贯彻幕府的一贯方针：推进公武合体路线，并握紧政治主导权。新选组得知消息，便向顶头上司申请将军上洛的护卫工作。
此时新选组一人局长近藤勇权力稳固，但其中一位副长——山南敬助，却因前一年的意外事故身受重伤，未能参加护卫行动。
事情要追溯到文久三年秋，新选组接到密报，大阪高丽桥附近的吴服屋内有非法浪士威胁店主收保护费的实情，于是刻不容缓，当即派出土方、山南前往镇压。
在这场混乱中，山南的爱刀「赤心冲光」从中间部断裂，伤痕无数，可想当时战况之惨烈。（这把刀现藏小岛资料馆）
也正是由于战况激烈，爱刀损毁严重，所以山南本人也受了重伤，因此一直在闭门静养，未能参与受伤之后的任何行动。就连家乡故人到访，山南也是闭门谢客，不曾露面。山南虽与土方同为副长，但长期间的蜇伏使他完全被隔离在新选组队务之外，大权彻底掌握在土方手中。相对的，土方虽被称为“鬼之副长”，但由于肩上的重担愈渐加重，责任感逐渐加强，使土方的心境又产生了一些变化。
元治元年四月，土方给老家的姐夫佐藤彦五郎写了一封信。
“我于去年春天上洛，虽然目前为止无太大建树，但如果为了将军家千秋之基业，就算战死也绝无怨言。请你把这封信当成一封遗书，我死后没有东西什么可以送你，就把这日记与头盔赠与你留作纪念吧。”
从这封信中可以得知两件事：一是土方已决心在京都为将军舍命而战；其二便是土方此时已为完全的佐幕派，决定了新选组今后的发展方向。
这个时候的新选组，工作范围仍然是市中巡逻、取缔不法浪人，与京都守护职、京都所司代共同分担京都全域的巡逻工作。实际上这种工作并非近藤等人心中所愿，他们上京的目的打从新德寺清河大演说时就已经明确，那就是将军的护卫工作。四月二十四日，新选组日后的竞争对手——“京都见回组”诞生了。这个组织是从御家人子弟中选拔出的、根红苗正的武士集团。与此同时，开始流传着将军家茂即将返回江户的传言。近藤听闻后心中更加不满：说好的将军护卫呢？如果这次将军东下返回，那么新选组存在的意义，便只剩下巡逻、视察工作了。
关于新选组的今后的发展、去向问题，近藤与土方商议许久，始终也没能得出个结论。其实新选组本身是个很矛盾的存在，它不像其他的组织、集团，有着明确的需要尽忠的主人，它是由众多浪士组成，而且并不完全属于任何一个藩主，这在日本的历史上几乎是史无前例的，因此它本身就处在一种极其尴尬的立场，近藤的迷惘也是情有可原的。
但近藤毕竟是近藤，只迷惘了一段时间，便重新确立目标，准备主动出击了。五月三日，近藤写了一封关于新选组的未来发展的建白书，经由会津藩转呈老中。
“……（前略）我等皆为尽忠报国的有志之士，去年承蒙厚爱得到市中警卫巡逻之权利，不胜感激。但是，我等上洛目的是为了保护将军安全而并非市中巡逻，如果将军就此返回江户，那么我等此番上洛便全无意义，勉强留在京都恐怕也只会令诸位徒增烦恼。因此，请立即下令遣散新选组，让我等辞职返乡吧。”
这一封言辞恳切的建白书，表面上看起来饱含一腔爱国热血，但要概括总结成一句大白话，那便是：你若不让我守卫将军，我便辞职返乡。
以辞职威胁老中，这在江户幕府的历史上恐怕还是头一回。这近藤并非真的想要告老还乡，他心里清楚，目前维持京都治安人手不够，此时正值用人之际，幕府怎么也不会放任拥有超强战斗能力的新选组解散，因此近藤玩的是一出以退为进的高招。当然，他这一步棋还有另外一个目的，那就是成为幕府家臣，鸟枪换炮彻底改变浪士身份。
老中在看完这封建白之后，果不其然，老中不愿遣散新选组，说是京都治安紊乱，现在正值用人之际，希望新选组各位大局为重，暂时继续维持治安的工作云云，临了还给众人发下一笔抚恤金，以安抚众人心态。
随后，由于见回组成员招聘进行得不顺利，应征的御家人是少之又少。正巧赶上近藤建白书事件，老中便知会京都守护职的会津藩，由他们出面劝说近藤勇，将新选组整个并入见回组麾下，并给予全员“同心”阶级的待遇。
这“同心”乃是幕臣中的最下等，且仅限于一代；而这见回组的首领，也必然会由位高禄厚之幕臣担任，轮不到他近藤勇的份。即使得了个低级幕臣身份，一局之长宝座丢了不说，整个倾注了试卫馆一行人心血的新选组都会落得被其他组织吞并的下场。思前想后，近藤在与町奉行商量之下，决定拒绝这次的招安。
于是见回组改由成功刺杀清河八郎的与力之一——佐佐木只三郎接管。
