自2,4-D于1946年开始使用以来，经过50多年的发展，除草剂已经成为现代农业生产体系的重要部分，在农田除草中发挥着重要作用。
除草剂之所以能起作用，在于它被植物的根、芽吸收后，能作用于特定位点，干扰植物的生理、生化代谢反应，导致植物生长受抑制或死亡，其起作用的方式有以下几类。
（1）抑制光合作用
主要通过抑制光合电子传递链、分流光合电子传递链的电子、抑制光合磷酸化、抑制色素的合成和抑制水光解等途径来抑制光合作用。这类除草剂有：二苯醚类、联吡啶类和敌稗，联吡啶类除草剂百草枯和敌草快等。
（2）抑制脂肪酸合成
脂质是植物细胞膜的重要组成成分，现已发现有多种除草剂能抑制脂肪酸的合成和链的伸长。如芳氧苯氧丙酸类、环己烯酮类、硫代胺基甲酸酯类、哒嗪酮类。
（3）抑制氨基酸的合成
如草甘膦、草丁膦、磺酰脲类、咪唑啉酮类和磺酰胺类等。
（4）干扰激素平衡
最早合成的有机除草剂苯氧乙酸类（如2,4-D等）以及苯甲酸类具有类似植物生长素的作用，这类除草剂通过干扰植物体内的激素调节，影响植物的形态发生，最终导致植物死亡。
（5）抑制微管与组织发育
植物细胞的骨架主要是由微管和微丝组成，它们保持细胞形态，在细胞分裂、生长和形态发生中起着重要的作用。目前，还没有商品化的除草剂干扰微丝。大量研究明确了很多除草剂直接干扰有丝分裂的纺锤体，使微管的机能发生障碍或抑制微管的形成，如二硝基苯胺类除草剂。