制作母种常采用组织分离法：选产生商品性状好的幼嫩、新鲜、清洁、无病虫的平菇做种菇，采摘后及时放入灭过菌的纸袋中带回接种室(箱)进行消毒。先用75%的酒精消毒双手，工具及种菇表面，然后用手撕开子实体，在菌盖与菌柄交界处用刀划成一个“田”字形，用接种钩钩取米粒大小的菌肉，迅速移接入PDA培养基斜面，塞上棉塞，在25~28℃下培养。
母种制作另一种方法是孢子分离法，要选择菇形商品性状好、外表清洁、无病虫、七八成熟的子实体，放入灭菌纸袋带回接种室（箱）。菌盖表面用无菌水冲洗数遍后，用滤纸吸干菌盖表面的水分，在接种箱内将菇柄切去，将种菇菌褶朝下，支撑置于培养皿内，12~24小时后就可在培养皿内看到一层白色的粉状孢子。
用接种环取少许平菇孢子于无菌水中稀释，用无菌注射器吸取孢子液在每支玻璃管斜面上滴上几滴、在适温下培养。孢子萌发后，挑取萌发早、长势好的菌落，进一步转管培养。
将分离选育出或引进的母种，再分别转接到新的玻璃管斜面培养基上，从而繁殖成新菌丝的过程，称之为转管或传代。一般1支母种可转接30~40支。转接时要严格进行无菌操作，以防污染，为了保持其活力，防止菌种退化，一般不宜多次转管或传代。
用取得的母种扩接转管或纯化前，要对场所和用具进行灭菌和消毒。场所天菌和消毒的主要方法有紫外线辐射灭菌和化学药物甲醛熏蒸等。紫外线辐射灭菌：就是灭菌室或接种箱用黑窗帘或黑布遮光，每20立方米空间用1支30瓦紫外线灯照射2小时。
甲醛熏蒸灭菌：在培养皿或其他容器内，按每立方米房间10毫升甲醛加5克高锰酸钾的比例配对，关好门窗闷一夜或更长时间，任甲醛挥发，可达到较好的灭菌目的。熏蒸后室内可喷洒25%~28%的氨水，或放置部分碳酸氢铵，以驱除刺激鼻眼的甲醛气味。
常用的消毒和灭菌方法还有：①按每立方米15~20克的用量点燃硫磺熏蒸；②用70%~80%的酒精或3%~5%来苏儿或0.5%~1%高锰酸钾1：1000的水溶液消毒皮肤及用具；③0.5%~1%石炭酸水溶液喷雾处理无菌室（箱)，或3%~5%石炭酸水溶液浸泡器械；④0.02%多菌灵喷洒培养料或其他物体表面，也可将其拌在培养料中防止霉菌污染。
无菌室或接种箱消毒后即可进行母种转管扩种了。左手拿分离得到（或购买）的母种管和待接种的斜面玻璃管，右手拿接种耙在酒精灯火焰上来回烧红，拔去菌种管的棉塞，将管口在火焰上烧一下，再把接种耙烧一下，迅速伸入母种玻璃管，稍加冷却后，切取米粒大小菌丝块（一定要带培养基)，迅速放入待接种玻璃管斜面中心位置，拿出接种耙后，再把管口灼烧一下，烤一下棉塞迅速塞上。
接种后的玻璃管，放入培养箱或培养室进行恒温(24~26℃)培养。培养室要空气新鲜、环境干净、无光或弱光，空气相对湿度70%左右，试管上盖上纱布或薄棉毯，拉上窗帘，形成无光培养，一般经8~14天，菌丝就可长满玻璃管斜面。
菌丝长满后的母种要及时取出使用或放置到3~5℃的冰箱中贮存。低温保藏法是最简便易行的保藏方法，每隔2~3个月转接1次。