大家好，今天给大家解读一篇题为 A TCF4-depen dent gene regulatory network confers resistance to immuno therapy in mela noma（TCF4依赖性基因调控网络对黑色素瘤免疫疗法产生耐药性）为了更好地理解免疫检查点阻断(ICB)的内在抗性，建立了治疗初期黑色素瘤生态系统的细胞结构的全面视图，并研究了其在ICB下的进化。
01
研究背景
为了更好地了解对免疫检查点阻断（ICB）的内在耐药性，我们对治疗初期黑色素瘤生态系统的细胞结构建立了一个全面的观点，并研究了其在ICB下的演变。使用单细胞、空间多组学，我们发现肿瘤微环境促进了复杂的黑色素瘤转录组景观的出现。
黑色素瘤细胞具有间充质样（MES）状态，这是一个已知对靶向治疗具有耐药性的群体，在对ICB无反应的早期治疗活检中显著富集。TCF4是这一景观的枢纽通过成为MES信号的主调节器和黑素细胞和抗原存在转录程序的抑制剂。
见图一
完善治疗初期人类黑色素瘤转录组景观。
图一
（A） 描述SPECIAL临床研究中样本采集时间、患者数量和方法的示意图。
（B） 生物信息学scRNA-seq分析工作流程的描述。
（C） 通过scRNA-seq分析并整合所有样本的恶性细胞的均匀流形近似和投影（UMAP）。
（D） 11种恶性细胞状态中每种状态的所选顶部差异表达标记基因的热图。
（E） 每个恶性状态的所选顶部差异表达调节子（通过SCENIC鉴定）的热图。
（F） 恶性细胞状态的前100个标记基因的AUCell评分取平均值，按行缩放，并在每个状态下重新绘制，以显示相似性跨州。
（G） 冲积图显示，所有9个重复转录簇都被来自基因的CNV推断鉴定的属于不同遗传亚克隆的细胞喂养表达式配置文件。
见图二
治疗初期黑色素瘤生态系统的空间映射。
图二
（A） 6个代表性治疗初期转移样本（淋巴结；2个不存在，3个不活跃，1个活跃）的空间转录组学（Visium，103 Genomics）。这个通过整合斑点与scRNA-seq数据来鉴定特定恶性和非恶性细胞类型/状态的定位。缩写如下：BECs，血管内皮细胞；淋巴管内皮细胞；树突状细胞；CAFs、癌症相关成纤维细胞。
（B） 在查询恶性状态和其他所有恶性和非恶性细胞类型之间计算的样本之间的平均k距离的热图/状态（按行规范化）。热图是根据每个病变的免疫表型进行分组的。
（C） 每个scRNA-seq样本的黑色素瘤抗原呈递细胞百分比和活化的CD8+T细胞百分比之间的正相关图（Spearman相关性测试）。
（D） CellChat39预测黑色素瘤抗原之间通过II型干扰素（IFN-II）、MHC I类和II类分子进行细胞间通信的可能性很高呈递细胞和各种免疫细胞类型。连接单元格的线的宽度表示概率强度。
（E） 多重免疫染色（米兰）和邻域分析证实了HLA DRhigh，而不是HLA DRlow黑色素瘤细胞与CD3+和CD8的接近性+T细胞（红色曲线，上部）和治疗初始样本（n=10）中的所有免疫细胞（红色线，下部）。x轴：考虑邻域的交互距离分析（mm）。y轴：互动得分（正值表示互动，负值表示回避）。
（F） 临床活检的代表性图像，其中HLA DRhigh而非HLA DRlow黑色素瘤细胞与CD8+免疫浸润共同定位。规模钢筋，600 mm。
见图三
黑色素瘤MES细胞的鉴定和原位定位。
图三
（A） 通过测试MES与所有其他恶性状态（左）和最小谱系基因（MLG）确定的MES状态的前50个标记基因的AUCell评分通过测试MES与癌症相关成纤维细胞（CAFs）进行鉴定（右），为CAFs和MES细胞绘制。
（B） 小提琴图显示三种选定的MLG标记基因和MITF在黑色素瘤MES中的高表达水平，而不是在CAFs中。
（C） 小提琴图显示四种选定MES标记基因在黑色素瘤MES和CAFs中的高表达水平。（A）-（C）的统计检验是双侧的Wilcoxon，***p<0.001。
（D） 来自（B）和（C）的标记基因在所有恶性细胞状态中的表达。色标反映平均表达水平和点的大小百分比表达细胞。
（E） 代表性治疗初期淋巴结转移的多重免疫染色（CODEX）和RNAscope图像。CD45、CD31和TCF4（黄色、青色、，分别为白色和白色）蛋白染色，而MLG的两个选定基因（S100A1、CDH19、SOX10加MITF；红色）和MES状态的mRNA（DCN、TCF4、THY1和LUM；绿色）组合在一起（顶部）。每四个基因的颜色划分如图所示（底部）。共表达MLGs和MES的MES细胞的细胞核基于DAPI染色对基因进行分割（深蓝色）。
见图四
黑色素瘤MES状态与ICB反应相关。
图四
（A） 在BT和OT样本以及两个反应组中鉴定的所有恶性细胞中抗原呈递和MES细胞的百分比。各自的p值在每次比较（双侧Wilcoxon检验）和圈出的显著差异的上方指出。代表性免疫染色图像的患者如（C）和（D）所示（GC15、GC16、GC33和GC39）。
（B） BT中所有恶性细胞中抗原呈递（左）和MES（右）细胞百分比的受试者操作特征（ROC）曲线（蓝色）和OT（绿色）样本。ROC曲线下面积（AUC）以95%置信区间（CI）表示。
（C） 用定向抗体染色的OT/应答者（R；GC15）和OT/非应答者（NR；GC33）样品的代表性多重免疫染色图像对抗HLA-DR（绿色）、巨噬细胞标志物CD68（蓝色）和黑色素瘤标志物（MITF，MLANA，S100；MEL，红色）。大部分细胞表达全部3MEL标记在R中对HLD-DR呈阳性（对CD68呈阴性），但在NR样本中不呈阳性。
（D） 来自用针对CD45的抗体染色的OT/R（GC39）和OT/NR（GC16）样品的病变的代表性CODEX/RNAscope图像（黄色）、CD31（青色）和TCF4（白色）以及针对MLG（S100A1、CDH19、SOX10加MITF；红色）和四个MES基因（DCN、TCF4、LUM和THY1；绿色在NR中可检测到MES细胞（MLG、四个MES基因和TCF4蛋白阳性，CD45和CD31阴性），但在R中未检测到样品。
（E） 在BT和OT样品以及两个反应组中鉴定的所有恶性细胞中抗原呈递样和MES样细胞的百分比先前描述的癌症队列30E，扩张器；NE，非扩展器；在每次比较（双侧Wilcoxon测试），并圈出显著差异。
（F） BT中所有恶性细胞中抗原呈递（左）和MES（右）细胞百分比的受试者操作特征（ROC）曲线（蓝色）和OT（绿色）样本。ROC曲线下面积（AUC）以95%置信区间（CI）表示。方框图表示具有对应于第25和第75个百分位数的下铰链和上铰链的中位数。上须从铰链延伸到最大距离铰链不超过1.5*IQR的值（其中IQR是四分位间距或第一个和第三个四分位之间的距离）。
见图五
TCF4协调多种黑色素瘤转录程序。
图五
（A） 基因集富集分析（GSEA）与EMT、抗原呈递、IFN信号传导相关的基因集富集图MM099细胞中TCF4沉默后的基因（大量RNA-seq，n=2个生物重复）。NES，归一化富集分数；FDR，错误发现率。
（B） 从（A）中选择的差异表达基因的热图。
（C） Western印迹分析显示外源性TCF4和在诱导TCF4过表达后MM011细胞中MITF内源性蛋白水平下调（TCF4 OE，用多西环素诱导）。在亲本（非诱导[NI]）细胞中的表达显示为对照。相对于GAPDH的水平量化指示加载控制。
（D） GSEA图显示在多西环素依赖性诱导TCF4后最高差异表达基因中与EMT相关的基因集富集在MM011细胞中的表达（TCF4 OE）（大量RNA-seq，n＝3个生物重复）。
（E） 从（D）中选择的差异表达基因的热图。
（F） 左图：黑色素瘤Ma-Mel-86c细胞与自体患者分离的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的共培养实验示意图。右图：暴露于诱导TCF4表达的自体Ma-Mel-86c肿瘤细胞4小时后，TNF-a+CD8+TIL的百分比（TCF4-OE）相对于控制条件（CTRL，未诱导）。显示了个体值、平均值和SEM（n=3个生物重复，用Welch校正的t检验，*p=0.02）。
（G） 左图：表达卵清蛋白（OVA）抗原的小鼠黑色素瘤YUMM1.7细胞与分离的CD8+T细胞之间的共培养实验示意图来自OT-1小鼠。右图：通过暴露于siRNA库对照的黑色素瘤细胞培养物中乳酸脱氢酶（LDH）的释放测量细胞/膜损伤（si-CTRL）或靶向TCF4的siRNA库（si-TCF4）。显示了单个值、平均值和SEM（n=3技术重复，Tukey多重比较试验，*调整后p<0.05，**调整后p<0.01，***调整后p<0.01）。
（H） 左图：工程化表达NY-ESO1抗原（NYE-A02）的黑色素瘤A375细胞与永生化细胞之间的共培养实验示意图T细胞Jurkat细胞被工程化以选择性表达针对NY-ESO-1的受体（NYE-TCR）。右图：24小时后Jurkat T细胞中CD69+细胞的百分比暴露于表达抗原NY-ESO-1的自体A375肿瘤细胞，其中TCF4使用siRNA库（si-TCF4）沉默。暴露于对照的细胞使用siRNA库（si-CTRL）作为对照。使用暴露于相同siRNA库并在没有Jurkat细胞的情况下培养的黑色素瘤细胞作为阴性细胞控件（CTRL）。Jurkat细胞仅用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA）和离子霉素（Iono）处理并用作阳性对照。单个值，平均值和SEM显示（n=3个技术重复，Tukey多重比较试验，***调整后p<0.0001）。
（I） RT-qPCR显示TCF4在表达靶向TCF4的shRNA的小鼠B16F10黑色素瘤细胞（sh-TCF4）中的敲除效率与细胞相比用非靶向shRNA（sh-CTRL）转导。显示了个体值、平均值和SEM（n=3个技术重复，Student t检验，***p<0.0001）。
（J） 上图：（I）-（L）所示临床前实验的实验设置示意图。下：将（I）中描述的细胞注射到C57BL/6小鼠中随后用抗PD-1或同种型对照（IgG）治疗，并将肿瘤体积绘制为时间的函数。各组平均肿瘤体积（±SEM）（n=6个生物重复，Wilcoxon检验，*p=0.039）。
（K） 在第24天（终点）从两个抗PD-1治疗的队列中收集的所有病变的肿瘤体积。注意，6个sh TCF4病变中有4个小于10 mm3
（L） 左图：两个抗PD-1治疗组肿瘤切片的代表性H&E染色。比例尺表示50毫米。右：的免疫荧光图像连续部分。CD45（绿色）蛋白染色，其在sh-TCF4病变中更丰富和分布，以及DAPI（蓝色）。
见图六
通过BET抑制靶向TCF4。
图六
（A） ATAC-seq峰指示MM057对照细胞（DMSO）中TCF4基因座上游和暴露于BET抑制剂ARV-771之后的染色质可及性区域。先前描述的未经处理的MM099和两个44个黑素细胞MM系（MM001和MM011）的ATAC-seq图谱35为也显示了。前面描述的BRD4结合位点在红色矩形中突出显示。
（B） RT-qPCR显示在MM099细胞中ARV-771暴露后TCF4水平的剂量依赖性下调（n＝3个技术重复，**p＜0.01、***p＜0.001）。
（C） 暴露于ARV-771的MM099细胞中所选差异表达基因的热图（批量RNA-seq，n=2个生物重复）。
（D） Venn图显示了在MM099细胞中TCF4和ARV-771处理沉默时下调的基因之间的重叠（大量RNA-seq，n=2生物复制、超几何测试）。
（E） GSEA图显示来自（D）的322个通常调节的基因在来自侵袭性（INV或MES）的基因中显著富集，而在基因中缺失来自增殖性（PRO或MEL）Verfaillie等人55的基因表达特征。
（F） 用BET（ARV-771，25nM）、BRAF和MEK抑制剂（达非尼20nM，曲美替尼4nM），si-TCF4，si-CTRL或其组合。显示了平均值和SEM（n=3个技术重复）。
（G） 将MM047、A375细胞用BET（MM047用ARV-771 100 nM，A375用25 nM）、BRAF和MEK抑制剂（达非尼2.5 nM，曲美替尼0.5 nMA375，曲美替尼仅20nM用于MM047）、si-TCF4、si-CTRL或其组合。热图总结了在最后一个时间点（150小时）收集的所有数据。
（H） 暴露于BET（ARV-771 25 nM）、BRAF和MEK抑制剂（达非尼20 nM、曲美替尼4 nM），si-TCF4，si-TCF 4 nM的MM099细胞培养物48小时的细胞活力CTRL或其组合。显示了平均值和SEM（n=3个技术重复，Tukey多重比较试验，**调整后p<0.01，***调整后p＜0.0001）。
（I） 如（G）中那样处理MM047、A375细胞。热图总结了在最后一个时间点（48小时）收集的所有数据。
02
研究结论
在基因或药理学上靶向TCF4，使用溴结构域抑制剂，增加MES细胞对ICB和靶向治疗的免疫原性和敏感性。因此，我们未涵盖TCF4依赖性调控网络，该网络协调多个转录程序和导致黑色素瘤对靶向治疗和ICB的耐药性。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
为了更好地了解对免疫检查点阻断（ICB）的内在耐药性，我们对治疗初期黑色素瘤生态系统的细胞结构建立了一个全面的观点，并研究了其在ICB下的演变。使用单细胞、空间多组学，我们发现肿瘤微环境促进了复杂的黑色素瘤转录组景观的出现。
黑色素瘤细胞具有间充质样（MES）状态，这是一个已知对靶向治疗具有耐药性的群体，在对ICB无反应的早期治疗活检中显著富集。TCF4是这一景观的枢纽通过成为MES信号的主调节器和黑素细胞和抗原存在转录程序的抑制剂。
见图一
完善治疗初期人类黑色素瘤转录组景观。
图一
（A） 描述SPECIAL临床研究中样本采集时间、患者数量和方法的示意图。
（B） 生物信息学scRNA-seq分析工作流程的描述。
（C） 通过scRNA-seq分析并整合所有样本的恶性细胞的均匀流形近似和投影（UMAP）。
（D） 11种恶性细胞状态中每种状态的所选顶部差异表达标记基因的热图。
（E） 每个恶性状态的所选顶部差异表达调节子（通过SCENIC鉴定）的热图。
（F） 恶性细胞状态的前100个标记基因的AUCell评分取平均值，按行缩放，并在每个状态下重新绘制，以显示相似性跨州。
（G） 冲积图显示，所有9个重复转录簇都被来自基因的CNV推断鉴定的属于不同遗传亚克隆的细胞喂养表达式配置文件。
见图二
治疗初期黑色素瘤生态系统的空间映射。
图二
（A） 6个代表性治疗初期转移样本（淋巴结；2个不存在，3个不活跃，1个活跃）的空间转录组学（Visium，103 Genomics）。这个通过整合斑点与scRNA-seq数据来鉴定特定恶性和非恶性细胞类型/状态的定位。缩写如下：BECs，血管内皮细胞；淋巴管内皮细胞；树突状细胞；CAFs、癌症相关成纤维细胞。
（B） 在查询恶性状态和其他所有恶性和非恶性细胞类型之间计算的样本之间的平均k距离的热图/状态（按行规范化）。热图是根据每个病变的免疫表型进行分组的。
（C） 每个scRNA-seq样本的黑色素瘤抗原呈递细胞百分比和活化的CD8+T细胞百分比之间的正相关图（Spearman相关性测试）。
（D） CellChat39预测黑色素瘤抗原之间通过II型干扰素（IFN-II）、MHC I类和II类分子进行细胞间通信的可能性很高呈递细胞和各种免疫细胞类型。连接单元格的线的宽度表示概率强度。
（E） 多重免疫染色（米兰）和邻域分析证实了HLA DRhigh，而不是HLA DRlow黑色素瘤细胞与CD3+和CD8的接近性+T细胞（红色曲线，上部）和治疗初始样本（n=10）中的所有免疫细胞（红色线，下部）。x轴：考虑邻域的交互距离分析（mm）。y轴：互动得分（正值表示互动，负值表示回避）。
（F） 临床活检的代表性图像，其中HLA DRhigh而非HLA DRlow黑色素瘤细胞与CD8+免疫浸润共同定位。规模钢筋，600 mm。
见图三
黑色素瘤MES细胞的鉴定和原位定位。
图三
（A） 通过测试MES与所有其他恶性状态（左）和最小谱系基因（MLG）确定的MES状态的前50个标记基因的AUCell评分通过测试MES与癌症相关成纤维细胞（CAFs）进行鉴定（右），为CAFs和MES细胞绘制。
（B） 小提琴图显示三种选定的MLG标记基因和MITF在黑色素瘤MES中的高表达水平，而不是在CAFs中。
（C） 小提琴图显示四种选定MES标记基因在黑色素瘤MES和CAFs中的高表达水平。（A）-（C）的统计检验是双侧的Wilcoxon，***p<0.001。
（D） 来自（B）和（C）的标记基因在所有恶性细胞状态中的表达。色标反映平均表达水平和点的大小百分比表达细胞。
（E） 代表性治疗初期淋巴结转移的多重免疫染色（CODEX）和RNAscope图像。CD45、CD31和TCF4（黄色、青色、，分别为白色和白色）蛋白染色，而MLG的两个选定基因（S100A1、CDH19、SOX10加MITF；红色）和MES状态的mRNA（DCN、TCF4、THY1和LUM；绿色）组合在一起（顶部）。每四个基因的颜色划分如图所示（底部）。共表达MLGs和MES的MES细胞的细胞核基于DAPI染色对基因进行分割（深蓝色）。
见图四
黑色素瘤MES状态与ICB反应相关。
图四
（A） 在BT和OT样本以及两个反应组中鉴定的所有恶性细胞中抗原呈递和MES细胞的百分比。各自的p值在每次比较（双侧Wilcoxon检验）和圈出的显著差异的上方指出。代表性免疫染色图像的患者如（C）和（D）所示（GC15、GC16、GC33和GC39）。
（B） BT中所有恶性细胞中抗原呈递（左）和MES（右）细胞百分比的受试者操作特征（ROC）曲线（蓝色）和OT（绿色）样本。ROC曲线下面积（AUC）以95%置信区间（CI）表示。
（C） 用定向抗体染色的OT/应答者（R；GC15）和OT/非应答者（NR；GC33）样品的代表性多重免疫染色图像对抗HLA-DR（绿色）、巨噬细胞标志物CD68（蓝色）和黑色素瘤标志物（MITF，MLANA，S100；MEL，红色）。大部分细胞表达全部3MEL标记在R中对HLD-DR呈阳性（对CD68呈阴性），但在NR样本中不呈阳性。
（D） 来自用针对CD45的抗体染色的OT/R（GC39）和OT/NR（GC16）样品的病变的代表性CODEX/RNAscope图像（黄色）、CD31（青色）和TCF4（白色）以及针对MLG（S100A1、CDH19、SOX10加MITF；红色）和四个MES基因（DCN、TCF4、LUM和THY1；绿色在NR中可检测到MES细胞（MLG、四个MES基因和TCF4蛋白阳性，CD45和CD31阴性），但在R中未检测到样品。
（E） 在BT和OT样品以及两个反应组中鉴定的所有恶性细胞中抗原呈递样和MES样细胞的百分比先前描述的癌症队列30E，扩张器；NE，非扩展器；在每次比较（双侧Wilcoxon测试），并圈出显著差异。
（F） BT中所有恶性细胞中抗原呈递（左）和MES（右）细胞百分比的受试者操作特征（ROC）曲线（蓝色）和OT（绿色）样本。ROC曲线下面积（AUC）以95%置信区间（CI）表示。方框图表示具有对应于第25和第75个百分位数的下铰链和上铰链的中位数。上须从铰链延伸到最大距离铰链不超过1.5*IQR的值（其中IQR是四分位间距或第一个和第三个四分位之间的距离）。
见图五
TCF4协调多种黑色素瘤转录程序。
图五
（A） 基因集富集分析（GSEA）与EMT、抗原呈递、IFN信号传导相关的基因集富集图MM099细胞中TCF4沉默后的基因（大量RNA-seq，n=2个生物重复）。NES，归一化富集分数；FDR，错误发现率。
（B） 从（A）中选择的差异表达基因的热图。
（C） Western印迹分析显示外源性TCF4和在诱导TCF4过表达后MM011细胞中MITF内源性蛋白水平下调（TCF4 OE，用多西环素诱导）。在亲本（非诱导[NI]）细胞中的表达显示为对照。相对于GAPDH的水平量化指示加载控制。
（D） GSEA图显示在多西环素依赖性诱导TCF4后最高差异表达基因中与EMT相关的基因集富集在MM011细胞中的表达（TCF4 OE）（大量RNA-seq，n＝3个生物重复）。
（E） 从（D）中选择的差异表达基因的热图。
（F） 左图：黑色素瘤Ma-Mel-86c细胞与自体患者分离的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的共培养实验示意图。右图：暴露于诱导TCF4表达的自体Ma-Mel-86c肿瘤细胞4小时后，TNF-a+CD8+TIL的百分比（TCF4-OE）相对于控制条件（CTRL，未诱导）。显示了个体值、平均值和SEM（n=3个生物重复，用Welch校正的t检验，*p=0.02）。
（G） 左图：表达卵清蛋白（OVA）抗原的小鼠黑色素瘤YUMM1.7细胞与分离的CD8+T细胞之间的共培养实验示意图来自OT-1小鼠。右图：通过暴露于siRNA库对照的黑色素瘤细胞培养物中乳酸脱氢酶（LDH）的释放测量细胞/膜损伤（si-CTRL）或靶向TCF4的siRNA库（si-TCF4）。显示了单个值、平均值和SEM（n=3技术重复，Tukey多重比较试验，*调整后p<0.05，**调整后p<0.01，***调整后p<0.01）。
（H） 左图：工程化表达NY-ESO1抗原（NYE-A02）的黑色素瘤A375细胞与永生化细胞之间的共培养实验示意图T细胞Jurkat细胞被工程化以选择性表达针对NY-ESO-1的受体（NYE-TCR）。右图：24小时后Jurkat T细胞中CD69+细胞的百分比暴露于表达抗原NY-ESO-1的自体A375肿瘤细胞，其中TCF4使用siRNA库（si-TCF4）沉默。暴露于对照的细胞使用siRNA库（si-CTRL）作为对照。使用暴露于相同siRNA库并在没有Jurkat细胞的情况下培养的黑色素瘤细胞作为阴性细胞控件（CTRL）。Jurkat细胞仅用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA）和离子霉素（Iono）处理并用作阳性对照。单个值，平均值和SEM显示（n=3个技术重复，Tukey多重比较试验，***调整后p<0.0001）。
（I） RT-qPCR显示TCF4在表达靶向TCF4的shRNA的小鼠B16F10黑色素瘤细胞（sh-TCF4）中的敲除效率与细胞相比用非靶向shRNA（sh-CTRL）转导。显示了个体值、平均值和SEM（n=3个技术重复，Student t检验，***p<0.0001）。
（J） 上图：（I）-（L）所示临床前实验的实验设置示意图。下：将（I）中描述的细胞注射到C57BL/6小鼠中随后用抗PD-1或同种型对照（IgG）治疗，并将肿瘤体积绘制为时间的函数。各组平均肿瘤体积（±SEM）（n=6个生物重复，Wilcoxon检验，*p=0.039）。
（K） 在第24天（终点）从两个抗PD-1治疗的队列中收集的所有病变的肿瘤体积。注意，6个sh TCF4病变中有4个小于10 mm3
（L） 左图：两个抗PD-1治疗组肿瘤切片的代表性H&E染色。比例尺表示50毫米。右：的免疫荧光图像连续部分。CD45（绿色）蛋白染色，其在sh-TCF4病变中更丰富和分布，以及DAPI（蓝色）。
见图六
通过BET抑制靶向TCF4。
图六
（A） ATAC-seq峰指示MM057对照细胞（DMSO）中TCF4基因座上游和暴露于BET抑制剂ARV-771之后的染色质可及性区域。先前描述的未经处理的MM099和两个44个黑素细胞MM系（MM001和MM011）的ATAC-seq图谱35为也显示了。前面描述的BRD4结合位点在红色矩形中突出显示。
（B） RT-qPCR显示在MM099细胞中ARV-771暴露后TCF4水平的剂量依赖性下调（n＝3个技术重复，**p＜0.01、***p＜0.001）。
（C） 暴露于ARV-771的MM099细胞中所选差异表达基因的热图（批量RNA-seq，n=2个生物重复）。
（D） Venn图显示了在MM099细胞中TCF4和ARV-771处理沉默时下调的基因之间的重叠（大量RNA-seq，n=2生物复制、超几何测试）。
（E） GSEA图显示来自（D）的322个通常调节的基因在来自侵袭性（INV或MES）的基因中显著富集，而在基因中缺失来自增殖性（PRO或MEL）Verfaillie等人55的基因表达特征。
（F） 用BET（ARV-771，25nM）、BRAF和MEK抑制剂（达非尼20nM，曲美替尼4nM），si-TCF4，si-CTRL或其组合。显示了平均值和SEM（n=3个技术重复）。
（G） 将MM047、A375细胞用BET（MM047用ARV-771 100 nM，A375用25 nM）、BRAF和MEK抑制剂（达非尼2.5 nM，曲美替尼0.5 nMA375，曲美替尼仅20nM用于MM047）、si-TCF4、si-CTRL或其组合。热图总结了在最后一个时间点（150小时）收集的所有数据。
（H） 暴露于BET（ARV-771 25 nM）、BRAF和MEK抑制剂（达非尼20 nM、曲美替尼4 nM），si-TCF4，si-TCF 4 nM的MM099细胞培养物48小时的细胞活力CTRL或其组合。显示了平均值和SEM（n=3个技术重复，Tukey多重比较试验，**调整后p<0.01，***调整后p＜0.0001）。
（I） 如（G）中那样处理MM047、A375细胞。热图总结了在最后一个时间点（48小时）收集的所有数据。
02
研究结论
在基因或药理学上靶向TCF4，使用溴结构域抑制剂，增加MES细胞对ICB和靶向治疗的免疫原性和敏感性。因此，我们未涵盖TCF4依赖性调控网络，该网络协调多个转录程序和导致黑色素瘤对靶向治疗和ICB的耐药性。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
