NANO-CHEMICALLY MODIFIED TETRACYCLINE-3 (nCMT-3) ATTENUATES ACUTE LUNG INJURY VIA BLOCKING sTREM-1 RELEASE AND NLRP3 INFLAMMASOME ACTIVATION
纳米四环素-3（nCMT-3）通过阻断斯特雷姆-1释放和NLRP3炎性小体激活减轻急性肺损伤
摘要-背景：我们开发了CMT-3（nCMT-3）的纳米制剂，以测试IT（雾化吸入） nCMT-3的多效性抗炎活性可以减轻LPS诱导的ALI的假设。
方法：C57 BL/6小鼠雾化吸入nCMT-3或生理盐水，2 h后雾化吸入LPS或生理盐水。在LPS后24小时在麻醉下处死所有存活的小鼠，然后收集血液（在EDTA中）、肺组织（用10%福尔马林肺组织学固定并冷冻用于蛋白质分析）和支气管肺泡灌洗液（BALF）。
动物和肺损伤模型雄性和雌性C57 BL/6小鼠（年龄：8周龄）本研究中使用的IT LPS剂量与任何实验组的死亡率均无关。
肺组织学
MMP水平/活性（酶谱法）
NLRP3蛋白和活化的caspase-1水平
血液和支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数
PMN弹性蛋白酶和髓细胞表达的可溶性触发受体-1（斯特雷姆-1）水平
TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-18和BALF蛋白水平
来评估LPS和nCMT-3对ALI的影响
结果如下：LPS诱导的ALI表现为肺组织病理学损伤（PMN浸润、肺泡增厚、水肿和实变），肺组织中MMP-2、-9水平和活性升高，NLRP3蛋白表达增加，caspase-1水平活化。LPS诱导的斯特雷姆-1、TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-18、PMN弹性蛋白酶和BALF蛋白水平的血浆和BALF水平的增加表明显著的肺/全身炎症和毛细血管渗漏。
BALF细胞学分析
从小鼠肺获得BALF，并用30.5mL无菌生理盐水，然后在250 ℃下离心用1 mL无菌盐水重悬沉淀。将100微升细胞悬浮液通过Cytospin离心机（Hettich ROTOFIX 32A）以1，000 rpm离心3分钟以将细胞固定在载玻片上。将载玻片风干并用Hema-3（Fisher Scientific，Kalamazoo，MI）染色用于分析。由不知情的评审员使用Nikon Eclipse TE 2000-U研究显微镜（Nikon，梅尔维尔，纽约州）在20个高倍视野（HPF）对中性粒细胞和巨噬细胞进行计数。
Western blot和ELISA
将冷冻的肺在RIPA缓冲液中匀浆，并将提取的蛋白质用于Western印迹分析。通过BCA微量测定试剂盒（Thermo Scientific，Rockford，IL）测定来自肺和BALF的总蛋白浓度。通过SDS-PAGE凝胶分离20微升蛋白质，然后转移到PVDF膜（Millipore Co.，有限公司、美国）。在室温下，将膜与在Tris缓冲盐水加0.5%Tween-20（TBS-T）中的5%脱脂乳（Bio-Rad Laboratories）一起孵育1小时，然后在48 ℃下与购自圣克鲁斯生物技术公司的一抗一起过夜，所述一抗包括半胱天冬酶-1（目录号：sc-56036，1：200稀释）和NLRP 3炎性体（目录号：sc-134306，1：200稀释）。将与辣根过氧化物酶（HRP）连接的第二抗体在室温下施加1小时，所述辣根过氧化物酶购自圣克鲁斯生物技术公司（目录号：1662408，Bio-Rad Laboratories）。根据制造商的说明书，使用ECL使抗体-抗原复合物可视化。采用Image J软件对图像进行光密度定量分析。将免疫反应性条带的相对密度归一化为相应GAPDH条带的密度。收集血液样品和BALF用于测量TNF-α，（目录号：50-112-8800，Invitrogen），IL-1b（目录号：50-112-8814，Invitrogen），IL 6（目录号：50-112-8863，Invitrogen）、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（目录号：ab 252356，Abcam）、可溶性TREM-1（目录号：EMTREM 1，Thermo Fisher Scientific Inc.），和IL-18（目录号：BMS 618 -3，Invitrogen）。根据制造商的说明书，使用商业ELISA试剂盒测量所有细胞因子。
肺损伤的组织学评估
通过气管滴入0.5 mL 10%中性福尔马林对肺进行膨胀固定，以进行组织学检查。将固定的肺包埋在石蜡中。肺组织的5微米切片用苏木精和伊红（H&E）染色。由两名独立的病理学家以设盲方式评价组织学。使用先前研究中描述的0-2评分系统进行急性肺损伤的组织病理学评估（19）。简言之，分别对肺泡腔和间质腔中的中性粒细胞进行计数。评价了透明膜、充满气隙的蛋白质碎片和间隔增厚。为了生成肺损伤评分，根据归因于每个特征的相关性对五个独立参数中的每一个进行加权，然后将其归一化为评价的视野数。在光学显微镜下，由设盲的审查员在400倍放大率下在20个高倍视野（HPF）中对每个载玻片的3个代表性视野进行计数。
明胶酶谱法
明胶酶谱法测定肺组织中MMP-2和MMP-9的活性。将10微克总蛋白在含有0.1%明胶作为MMP消化底物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上进行电泳。电泳后，将凝胶孵育24小时，然后用考马斯蓝染色，并通过定量底物裂解的透明条带来评估MMP活性。MMPs通过其分子量和乙二胺四乙酸或菲咯啉的抑制作用来鉴定。使用NIH Image J软件通过扫描光密度分析来定量活性。
统计分析
数据表示为平均值SEM等使用GraphPad Prism软件（版本5.0）进行数据的统计分析。每个实验组的样本量（n¼x）见图例。采用单因素方差分析（单因素ANOVA）和Bonferroni多重比较检验确定组间差异。组间差异在P<0.05时被认为是显著的。所有数据均来自三个或更多个独立实验。
纳米四环素-3（nCMT-3）通过阻断斯特雷姆-1释放和NLRP3炎性小体激活减轻急性肺损伤
摘要-背景：我们开发了CMT-3（nCMT-3）的纳米制剂，以测试IT（雾化吸入） nCMT-3的多效性抗炎活性可以减轻LPS诱导的ALI的假设。
方法：C57 BL/6小鼠雾化吸入nCMT-3或生理盐水，2 h后雾化吸入LPS或生理盐水。在LPS后24小时在麻醉下处死所有存活的小鼠，然后收集血液（在EDTA中）、肺组织（用10%福尔马林肺组织学固定并冷冻用于蛋白质分析）和支气管肺泡灌洗液（BALF）。
动物和肺损伤模型雄性和雌性C57 BL/6小鼠（年龄：8周龄）本研究中使用的IT LPS剂量与任何实验组的死亡率均无关。
肺组织学
MMP水平/活性（酶谱法）
NLRP3蛋白和活化的caspase-1水平
血液和支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数
PMN弹性蛋白酶和髓细胞表达的可溶性触发受体-1（斯特雷姆-1）水平
TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-18和BALF蛋白水平
来评估LPS和nCMT-3对ALI的影响
结果如下：LPS诱导的ALI表现为肺组织病理学损伤（PMN浸润、肺泡增厚、水肿和实变），肺组织中MMP-2、-9水平和活性升高，NLRP3蛋白表达增加，caspase-1水平活化。LPS诱导的斯特雷姆-1、TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-18、PMN弹性蛋白酶和BALF蛋白水平的血浆和BALF水平的增加表明显著的肺/全身炎症和毛细血管渗漏。
BALF细胞学分析
从小鼠肺获得BALF，并用30.5mL无菌生理盐水，然后在250 ℃下离心用1 mL无菌盐水重悬沉淀。将100微升细胞悬浮液通过Cytospin离心机（Hettich ROTOFIX 32A）以1，000 rpm离心3分钟以将细胞固定在载玻片上。将载玻片风干并用Hema-3（Fisher Scientific，Kalamazoo，MI）染色用于分析。由不知情的评审员使用Nikon Eclipse TE 2000-U研究显微镜（Nikon，梅尔维尔，纽约州）在20个高倍视野（HPF）对中性粒细胞和巨噬细胞进行计数。
Western blot和ELISA
将冷冻的肺在RIPA缓冲液中匀浆，并将提取的蛋白质用于Western印迹分析。通过BCA微量测定试剂盒（Thermo Scientific，Rockford，IL）测定来自肺和BALF的总蛋白浓度。通过SDS-PAGE凝胶分离20微升蛋白质，然后转移到PVDF膜（Millipore Co.，有限公司、美国）。在室温下，将膜与在Tris缓冲盐水加0.5%Tween-20（TBS-T）中的5%脱脂乳（Bio-Rad Laboratories）一起孵育1小时，然后在48 ℃下与购自圣克鲁斯生物技术公司的一抗一起过夜，所述一抗包括半胱天冬酶-1（目录号：sc-56036，1：200稀释）和NLRP 3炎性体（目录号：sc-134306，1：200稀释）。将与辣根过氧化物酶（HRP）连接的第二抗体在室温下施加1小时，所述辣根过氧化物酶购自圣克鲁斯生物技术公司（目录号：1662408，Bio-Rad Laboratories）。根据制造商的说明书，使用ECL使抗体-抗原复合物可视化。采用Image J软件对图像进行光密度定量分析。将免疫反应性条带的相对密度归一化为相应GAPDH条带的密度。收集血液样品和BALF用于测量TNF-α，（目录号：50-112-8800，Invitrogen），IL-1b（目录号：50-112-8814，Invitrogen），IL 6（目录号：50-112-8863，Invitrogen）、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（目录号：ab 252356，Abcam）、可溶性TREM-1（目录号：EMTREM 1，Thermo Fisher Scientific Inc.），和IL-18（目录号：BMS 618 -3，Invitrogen）。根据制造商的说明书，使用商业ELISA试剂盒测量所有细胞因子。
肺损伤的组织学评估
通过气管滴入0.5 mL 10%中性福尔马林对肺进行膨胀固定，以进行组织学检查。将固定的肺包埋在石蜡中。肺组织的5微米切片用苏木精和伊红（H&E）染色。由两名独立的病理学家以设盲方式评价组织学。使用先前研究中描述的0-2评分系统进行急性肺损伤的组织病理学评估（19）。简言之，分别对肺泡腔和间质腔中的中性粒细胞进行计数。评价了透明膜、充满气隙的蛋白质碎片和间隔增厚。为了生成肺损伤评分，根据归因于每个特征的相关性对五个独立参数中的每一个进行加权，然后将其归一化为评价的视野数。在光学显微镜下，由设盲的审查员在400倍放大率下在20个高倍视野（HPF）中对每个载玻片的3个代表性视野进行计数。
明胶酶谱法
明胶酶谱法测定肺组织中MMP-2和MMP-9的活性。将10微克总蛋白在含有0.1%明胶作为MMP消化底物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上进行电泳。电泳后，将凝胶孵育24小时，然后用考马斯蓝染色，并通过定量底物裂解的透明条带来评估MMP活性。MMPs通过其分子量和乙二胺四乙酸或菲咯啉的抑制作用来鉴定。使用NIH Image J软件通过扫描光密度分析来定量活性。
统计分析
数据表示为平均值SEM等使用GraphPad Prism软件（版本5.0）进行数据的统计分析。每个实验组的样本量（n¼x）见图例。采用单因素方差分析（单因素ANOVA）和Bonferroni多重比较检验确定组间差异。组间差异在P<0.05时被认为是显著的。所有数据均来自三个或更多个独立实验。
