一、磷酸化蛋白WB怎么跑？
Western Blot作为检测蛋白质磷酸化状态的重要手段，其操作流程与非磷酸化蛋白检测相似，但磷酸化蛋白因含量稀少且易失修饰，检测难度增加。失败原因多样，包括封闭不当、抗体选择失误或样本中磷酸化蛋白含量过低。以下要点助力磷酸化蛋白实验成功。
二、磷酸化蛋白表达量评估
蛋白磷酸化受多种刺激影响，需结合文献、预实验及PhosphoSitePlus数据库，综合确定表达水平。
三、WB检测磷酸化蛋白关键点
01
样本处理优化
为确保裂解过程免受蛋白酶与磷酸酶干扰，样本需置冰上操作，并选用预冷缓冲液。加入蛋白酶及磷酸酶抑制剂至裂解液中很重要，否则Western blot可能出现条带浅淡乃至缺失。此外，为防细菌源磷酸酶污染，所有试剂与凝胶均需保持无菌清洁状态。
02
样本上样调整
鉴于磷酸化蛋白仅占总蛋白量的约10%，其低丰度特性易致Western Blot信号微弱。因此，可通过增加每样品上样蛋白量来增强磷酸化条带的清晰度。
03
总蛋白含量检测
为区分Western Blot信号缺失是因磷酸化效率低还是分离不充分，需同时检测总蛋白含量。磷酸化蛋白与总蛋白比值的变化，才是磷酸化水平变化的真实反映。
通常，两者在Western Blot上的条带位置相近，故可在磷酸化抗体处理后，进行膜脱除，再孵育总蛋白抗体，以确保磷酸化水平变化的准确检测。Stripping Buffer配制：0.76g Tris碱、2g SDS、700μl β-巯基乙醇，加蒸馏水至100ml，盐酸调pH至6.8。
04
抗体精选
磷酸化检测质量依赖于所选抗体。为确保实验准确可靠，应选用高度特异性的磷酸化蛋白抗体，并参考高质量文献进行选择。
实验过程中，需根据实际情况调整抗体稀释倍数，以达到最佳检测效果。严谨执行此步骤，是保障Western Blot结果可靠性与科学性的关键。
05
封闭条件优化
Western Blot实验中，建议4℃下抗体与膜上蛋白孵育过夜。推荐使用实验级脱脂牛奶作为抗体稀释液，避免实验级奶粉中的磷酸酶等杂质干扰抗体结合。
可考虑使用牛血清白蛋白（BSA）或无蛋白封闭剂。同时，注意避免膜封闭、洗涤时间过长，以及洗涤时摇床转速过高，以确保实验效果。
06
检测条件微调
为化学发光检测挑选合适底物后，需精心调整底物浓度、孵育时长及温度，以确保检测结果的清晰与准确。孵育时间的把控尤为关键，需依据实验需求精细调整，避免时间过长或过短对结果造成干扰。
07
结果分析
磷酸化蛋白检测中，非特异性条带时有发生。此时，需借助对照组进行深入分析与判断。区分特异性与非特异性条带，对准确解读实验结果至关重要。为增强结果可靠性，建议增设阴性及阳性对照，双重验证实验数据的准确与可靠。
08
内参科学设置
磷酸化蛋白检测需双管齐下，设置两重内参以保障实验准确性。首先，需检测磷酸化蛋白对应的总蛋白，如检测ERK磷酸化，则须同时检测ERK总蛋白。仅凭磷酸化蛋白表达变化判断结果不够严谨，需结合其与总蛋白的比值变化，方能准确反映磷酸化水平的变化。
另需选用常规内参，如actin或GAPDH，作为实验体系的质控标准，确保样品加载量一致，有效排除体系本身对实验结果的影响。