一、实验原理
Western blot技术（亦称作蛋白质印迹法）是一种在科研中频繁应用的手段，用于分离并确认蛋白质的身份。该技术通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（即SDS-PAGE）技术，将样本中的各类蛋白质进行分离，随后将这些已分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上。此后的步骤涉及将膜与目标蛋白质的特异性抗体共同孵育。在洗涤膜的过程中，非特异性结合的抗体被去除，仅留下与目标蛋白质紧密结合的抗体，最终通过胶片显影或荧光扫描的方式来检测这些结合的抗体。
由于抗体的特异性，通常仅能看到一条明确的条带，条带的宽窄反映了蛋白质的数量。通过分析特定反应出现的位置及其强度，可以揭示目标蛋白在特定细胞或组织提取物中的表达情况。得益于凝胶电泳的高分辨率以及免疫反应的强特异性和高灵敏度，Western blot技术能够检测到低至1ng的目标蛋白。因此，它在分子生物学、生物化学、免疫遗传学等多个生物学分支中得到了广泛应用。
二、实验操作步骤
1. 样品准备阶段：
1）制备冰块，并备齐冰盒以供使用。
2）配制细胞裂解液：依据细胞数量确定所需裂解液量，通常六孔板每孔需50ul。裂解液由100ul碧云天裂解液、1ul蛋白酶抑制剂混合物及1ul PMSF组成。
3）根据实验需求准备细胞：首先去除培养基，接着用1×PBS清洗三次以去除培养基中的血清成分。然后向每个孔（六孔板）中加入适量裂解液，利用细胞刮迅速将细胞刮下并转移至1.5ml离心管中，置于冰上静置20分钟后进行振荡混合，再次置于冰上10分钟。
4）以12,000g的转速在4℃条件下离心15分钟，收集上清液至另一1.5ml离心管中。
5）取2.5ul样品与22.5ul三蒸水混合稀释，用于BCA法测定蛋白质浓度。
6）剩余样品加入5×Loading Buffer（按照2.5ml Buffer对应10ml蛋白的比例），在95℃条件下加热10分钟（期间需振荡一次）。
7）处理后的样品可直接用于电泳或分装后在-80°C条件下长期保存。
2. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1）制备分离胶（每块凝胶需5ml）。
2）谨慎地将分离胶注入制胶模具中，预留约2cm的空间（即制胶架红色边框下缘）以供后续注入浓缩胶，并在顶层覆盖去离子水。静置约30分钟待其凝固。
3）接着制备浓缩胶（每块凝胶需2ml）。
4）将浓缩胶注入分离胶上端时需注意避免产生气泡。
5）插入梳子并等待浓缩胶凝固（当胶与梳子间出现明显分界且分离胶凝固时间超过2小时），之后用双蒸水清洗孔道以去除凝胶碎片，并用滤纸吸干水分。
6）将凝胶置于电泳槽中，上下槽均加入1×电泳缓冲液（注意缓冲液重复使用次数不应超过3次）。
7）进行上样操作：在marker孔中加入5ul prestained marker与适量1×上样Buffer混合至与sample孔总体积相同。Sample的上样量通常为15-25μl，需先在heating block中95℃加热5-10分钟（期间振荡一次），然后快速离心后进行电泳；对于未加载sample的孔道，则需加入等体积的1×上样Buffer。
8）电泳过程：初始阶段采用恒压60-80V进行电泳，当样品跑过浓缩胶后，将电压提高至100-120V。电泳时间需根据目标蛋白的大小及marker的位置来确定，通常当目标蛋白跑至分离胶三分之二的位置时即可停止电泳。
3. 膜转移环节：
1）根据Marker的指示以及目标条带的位置，对凝胶进行切割（切割时需做好标记以便识别）。随后，将切割好的凝胶浸入转膜缓冲液中，浸泡时间为15分钟。
2）对PVDF膜进行标记后，先将其浸入甲醇中活化1分钟，然后连同4张3mm厚的滤纸和海绵一起浸入转移缓冲液中，浸泡同样为15分钟。
3）接下来制作“转膜三明治”：按照纤维垫、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、纤维垫的顺序依次叠放。在叠放过程中，需确保每一层都对齐且没有气泡产生。
4）进行转膜操作：转膜的时间需根据之前确定的条件来设定。在转膜过程中，PVDF膜应连接正极（通常为红色端），而凝胶则连接负极（通常为黑色端）。
4. 膜的封闭与抗体孵育过程：
1）转膜完成后，用10ml的1×TBS溶液在室温下洗膜10分钟。
2）接着，用5ml的奶粉封闭液在室温下孵育膜2小时，或者在4℃条件下平缓摇动过夜。由于奶粉较难溶解，因此需提前至少1小时进行配制。
3）用10ml的TBS/T溶液洗膜3次，每次5分钟。
4）然后，加入5ml的一抗稀释缓冲液（抗体需根据说明书进行稀释），在室温下孵育2小时，或者在4℃条件下平缓摇动过夜。孵育完成后，回收一抗，并按5ul/ml的比例加入叠氮钠以抑制细菌生长。一抗可在4℃条件下保存（不常用的抗体可置于-20℃条件下长期保存），并可重复使用。
5）再次用10ml的TBS/T溶液洗膜3次，每次5分钟。
6）随后，加入二抗（通常按1：2000的比例稀释），在室温下平缓摇动孵育1小时。
7）最后，再次用10ml的TBS/T溶液洗膜3次，每次5分钟。
5. 显影与定影（或荧光扫描）步骤：
对于传统的显影与定影方法：
1）首先铺设保鲜膜，并在吸水纸上再铺一层保鲜膜。然后，将水、显影液（若颜色变深则不能使用）和定影液分别倒入各自的容器中。将2.5ml的ECL-A液和2.5ml的ECL-B液混合，并避光保存。将ECL混合液和膜带入暗房，关好门并拉好遮光布。将ECL混合液倒入小盒中，用吸水纸轻轻吸干膜上的多余液体，然后将膜放入ECL混合液中，在室温下摇动5分钟，使ECL均匀覆盖在膜上。之后，用吸水纸吸干膜上的液体，将膜面朝下包在保鲜膜上，并置于夹子上。剪好X-film（注意只能捏住X-film的边缘），放在膜上，并根据条带的亮度调整曝光时间。通常可先曝光2分钟，观察条带的深浅，再确定最佳的曝光时间。
2）显影与定影：将X-film取出，放入显影液中浸泡一定时间（具体时间根据目标条带的强度和背景而定），然后用水冲洗一次，再放入定影液中定影5分钟以上。
随着技术的进步，现在许多实验室已经很少使用传统的胶片显影与定影方法。取而代之的是，在孵育发光二抗后，直接进行荧光扫描。这类仪器种类繁多，操作方法也因实验室配置的不同而有所差异。
Western blot技术（亦称作蛋白质印迹法）是一种在科研中频繁应用的手段，用于分离并确认蛋白质的身份。该技术通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（即SDS-PAGE）技术，将样本中的各类蛋白质进行分离，随后将这些已分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上。此后的步骤涉及将膜与目标蛋白质的特异性抗体共同孵育。在洗涤膜的过程中，非特异性结合的抗体被去除，仅留下与目标蛋白质紧密结合的抗体，最终通过胶片显影或荧光扫描的方式来检测这些结合的抗体。
由于抗体的特异性，通常仅能看到一条明确的条带，条带的宽窄反映了蛋白质的数量。通过分析特定反应出现的位置及其强度，可以揭示目标蛋白在特定细胞或组织提取物中的表达情况。得益于凝胶电泳的高分辨率以及免疫反应的强特异性和高灵敏度，Western blot技术能够检测到低至1ng的目标蛋白。因此，它在分子生物学、生物化学、免疫遗传学等多个生物学分支中得到了广泛应用。
二、实验操作步骤
1. 样品准备阶段：
1）制备冰块，并备齐冰盒以供使用。
2）配制细胞裂解液：依据细胞数量确定所需裂解液量，通常六孔板每孔需50ul。裂解液由100ul碧云天裂解液、1ul蛋白酶抑制剂混合物及1ul PMSF组成。
3）根据实验需求准备细胞：首先去除培养基，接着用1×PBS清洗三次以去除培养基中的血清成分。然后向每个孔（六孔板）中加入适量裂解液，利用细胞刮迅速将细胞刮下并转移至1.5ml离心管中，置于冰上静置20分钟后进行振荡混合，再次置于冰上10分钟。
4）以12,000g的转速在4℃条件下离心15分钟，收集上清液至另一1.5ml离心管中。
5）取2.5ul样品与22.5ul三蒸水混合稀释，用于BCA法测定蛋白质浓度。
6）剩余样品加入5×Loading Buffer（按照2.5ml Buffer对应10ml蛋白的比例），在95℃条件下加热10分钟（期间需振荡一次）。
7）处理后的样品可直接用于电泳或分装后在-80°C条件下长期保存。
2. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1）制备分离胶（每块凝胶需5ml）。
2）谨慎地将分离胶注入制胶模具中，预留约2cm的空间（即制胶架红色边框下缘）以供后续注入浓缩胶，并在顶层覆盖去离子水。静置约30分钟待其凝固。
3）接着制备浓缩胶（每块凝胶需2ml）。
4）将浓缩胶注入分离胶上端时需注意避免产生气泡。
5）插入梳子并等待浓缩胶凝固（当胶与梳子间出现明显分界且分离胶凝固时间超过2小时），之后用双蒸水清洗孔道以去除凝胶碎片，并用滤纸吸干水分。
6）将凝胶置于电泳槽中，上下槽均加入1×电泳缓冲液（注意缓冲液重复使用次数不应超过3次）。
7）进行上样操作：在marker孔中加入5ul prestained marker与适量1×上样Buffer混合至与sample孔总体积相同。Sample的上样量通常为15-25μl，需先在heating block中95℃加热5-10分钟（期间振荡一次），然后快速离心后进行电泳；对于未加载sample的孔道，则需加入等体积的1×上样Buffer。
8）电泳过程：初始阶段采用恒压60-80V进行电泳，当样品跑过浓缩胶后，将电压提高至100-120V。电泳时间需根据目标蛋白的大小及marker的位置来确定，通常当目标蛋白跑至分离胶三分之二的位置时即可停止电泳。
3. 膜转移环节：
1）根据Marker的指示以及目标条带的位置，对凝胶进行切割（切割时需做好标记以便识别）。随后，将切割好的凝胶浸入转膜缓冲液中，浸泡时间为15分钟。
2）对PVDF膜进行标记后，先将其浸入甲醇中活化1分钟，然后连同4张3mm厚的滤纸和海绵一起浸入转移缓冲液中，浸泡同样为15分钟。
3）接下来制作“转膜三明治”：按照纤维垫、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、纤维垫的顺序依次叠放。在叠放过程中，需确保每一层都对齐且没有气泡产生。
4）进行转膜操作：转膜的时间需根据之前确定的条件来设定。在转膜过程中，PVDF膜应连接正极（通常为红色端），而凝胶则连接负极（通常为黑色端）。
4. 膜的封闭与抗体孵育过程：
1）转膜完成后，用10ml的1×TBS溶液在室温下洗膜10分钟。
2）接着，用5ml的奶粉封闭液在室温下孵育膜2小时，或者在4℃条件下平缓摇动过夜。由于奶粉较难溶解，因此需提前至少1小时进行配制。
3）用10ml的TBS/T溶液洗膜3次，每次5分钟。
4）然后，加入5ml的一抗稀释缓冲液（抗体需根据说明书进行稀释），在室温下孵育2小时，或者在4℃条件下平缓摇动过夜。孵育完成后，回收一抗，并按5ul/ml的比例加入叠氮钠以抑制细菌生长。一抗可在4℃条件下保存（不常用的抗体可置于-20℃条件下长期保存），并可重复使用。
5）再次用10ml的TBS/T溶液洗膜3次，每次5分钟。
6）随后，加入二抗（通常按1：2000的比例稀释），在室温下平缓摇动孵育1小时。
7）最后，再次用10ml的TBS/T溶液洗膜3次，每次5分钟。
5. 显影与定影（或荧光扫描）步骤：
对于传统的显影与定影方法：
1）首先铺设保鲜膜，并在吸水纸上再铺一层保鲜膜。然后，将水、显影液（若颜色变深则不能使用）和定影液分别倒入各自的容器中。将2.5ml的ECL-A液和2.5ml的ECL-B液混合，并避光保存。将ECL混合液和膜带入暗房，关好门并拉好遮光布。将ECL混合液倒入小盒中，用吸水纸轻轻吸干膜上的多余液体，然后将膜放入ECL混合液中，在室温下摇动5分钟，使ECL均匀覆盖在膜上。之后，用吸水纸吸干膜上的液体，将膜面朝下包在保鲜膜上，并置于夹子上。剪好X-film（注意只能捏住X-film的边缘），放在膜上，并根据条带的亮度调整曝光时间。通常可先曝光2分钟，观察条带的深浅，再确定最佳的曝光时间。
2）显影与定影：将X-film取出，放入显影液中浸泡一定时间（具体时间根据目标条带的强度和背景而定），然后用水冲洗一次，再放入定影液中定影5分钟以上。
随着技术的进步，现在许多实验室已经很少使用传统的胶片显影与定影方法。取而代之的是，在孵育发光二抗后，直接进行荧光扫描。这类仪器种类繁多，操作方法也因实验室配置的不同而有所差异。
