CoIP-Mass检测原理: 细胞内蛋白互作组CoIP-Mass检测,即免疫沉淀结合质谱分析检测,是研究细胞内蛋白互作的常规前置技术。
CoIP-Mass检测要点:
(1)试验设计:尽量进行试验组别设计和进行生物学重复检测,提高后续验证的阳性率。常规过表达单组(Ab IP vs IgG IP);动态互作组学(实验组vs对照组vs Ig组)。根据目的设计适当的生物学重复。如果后续以IP-Mass数据进行互作组标准分析,则需要3-4组生物学重复;如果后续以寻找关键互作蛋白,进行机制深入研究,则建议1-2次生物学重复。经验显示单次重复假阳性率90%。
(2)蛋白表达和细胞量:细胞用量要求大(2-10e7细胞量),建议不少于5e7(金标准:320g离心细胞量50ul,保障项目用量)。低表达蛋白,建议使用过表达组进行检测。蛋白表达可根据WB结果或初步根据数据库判定。
(3)抗体关键质控:抗体特异性和亲和效价要求高,尽量采用标签抗体或经过IP效果验证的抗体。抗体质量参差不齐和存在非特异性结合,IP-MS需做WB和IP-WB质控。初次和检测IP都需要做WB质控。正式IP可同时增加考染/银染质控。
(4)IP送样建议:IP质谱后需用PBS清洗去除NP40等去垢剂,不建议对蛋白进行洗脱处理送样,避免丢失互作蛋白信息。
(5)互作蛋白筛选和验证:数据分析以非标定量信号强度(LFQ intensity和FC>10)作为强阳筛选,以文献查阅,功能匹配,批量IP-WB验证,提高验证成功率。理想IP-MS结果的蛋白定量都到超过1000种蛋白。其中绝大部分蛋白为非特异结合或背景蛋白。以目的蛋白的富集信号强度和差异倍数作为参考(相对最强信号和差异),分析实验组中显著定量较高且差异较大的蛋白,作为重要候选蛋白。同时对重要候选蛋白进行STRING互作分析,文献分析,目的蛋白功能匹配分析,选择最优的4-5个蛋白进行IP-WB验证,提高IP-WB成功率。
CoIP-Mass优劣势:
优势:高通量获得目的蛋白的专属蛋白互作库。
劣势:技术门槛高,一般需要整包交给专业的服务商开展检测
如有相关科研问题,欢迎留言探讨。
CoIP-Mass检测要点:
(1)试验设计:尽量进行试验组别设计和进行生物学重复检测,提高后续验证的阳性率。常规过表达单组(Ab IP vs IgG IP);动态互作组学(实验组vs对照组vs Ig组)。根据目的设计适当的生物学重复。如果后续以IP-Mass数据进行互作组标准分析,则需要3-4组生物学重复;如果后续以寻找关键互作蛋白,进行机制深入研究,则建议1-2次生物学重复。经验显示单次重复假阳性率90%。
(2)蛋白表达和细胞量:细胞用量要求大(2-10e7细胞量),建议不少于5e7(金标准:320g离心细胞量50ul,保障项目用量)。低表达蛋白,建议使用过表达组进行检测。蛋白表达可根据WB结果或初步根据数据库判定。
(3)抗体关键质控:抗体特异性和亲和效价要求高,尽量采用标签抗体或经过IP效果验证的抗体。抗体质量参差不齐和存在非特异性结合,IP-MS需做WB和IP-WB质控。初次和检测IP都需要做WB质控。正式IP可同时增加考染/银染质控。
(4)IP送样建议:IP质谱后需用PBS清洗去除NP40等去垢剂,不建议对蛋白进行洗脱处理送样,避免丢失互作蛋白信息。
(5)互作蛋白筛选和验证:数据分析以非标定量信号强度(LFQ intensity和FC>10)作为强阳筛选,以文献查阅,功能匹配,批量IP-WB验证,提高验证成功率。理想IP-MS结果的蛋白定量都到超过1000种蛋白。其中绝大部分蛋白为非特异结合或背景蛋白。以目的蛋白的富集信号强度和差异倍数作为参考(相对最强信号和差异),分析实验组中显著定量较高且差异较大的蛋白,作为重要候选蛋白。同时对重要候选蛋白进行STRING互作分析,文献分析,目的蛋白功能匹配分析,选择最优的4-5个蛋白进行IP-WB验证,提高IP-WB成功率。
CoIP-Mass优劣势:
优势:高通量获得目的蛋白的专属蛋白互作库。
劣势:技术门槛高,一般需要整包交给专业的服务商开展检测
如有相关科研问题,欢迎留言探讨。