第一步，确定TRIM56促使FASN泛素化位点
为了进一步研究trim56介导的FASN降解的分子机制，过表达FLAG-TRIM56，并用氯喹（一种溶酶体依赖蛋白降解的药物抑制剂）或MG132（一种蛋白酶体依赖蛋白降解的抑制剂）治疗肝细胞，Western blot分析显示，TRIM56过表达诱导的FASN下调是由MG132挽救的，表明蛋白酶体依赖性的FASN降解可能起主要作用（图1a）。IP-WB实验显示TRIM56过表达导致FASN泛素化增强（图1b-c）。泛素中存在多个位点会导致底物泛素化，研究了泛素化的具体位点，Co-IP实验发现K48链的多泛素化在FASN的多泛素化中发挥了主要作用（图1d）。在K48O过表达的细胞中，FASN的泛素化增加，而K48R过表达的细胞则没有增加，这进一步证实了这一点（图1e）。表明TRIM56使FASN的K48链发生泛素化。
第二步，TRIM56对FASN的泛素化，依赖TRIM56 CTD区域与FASN互作
前面的结果显示TRIM56的CTD （522-755 aa）与FASN相互作用。IP-WB实验显示，过表达TRIM56 （1-521 aa）片段（无法与FASN结合）未能增加FASN多泛素化（图1f），表明522-575位点aa对于TRIM56-FASN相互作用和FASN蛋白不稳定性至关重要。
第三步，TRIM56对FASN的泛素化，依赖其E3泛素连接酶活性
构建TRIM56 (21AACC24) （E3泛素连接酶活性缺陷突变体），IP-WB实验发现TRIM56酶失活突变体未能增加FASN蛋白的泛素化（图1g）。与该结果一致，WT TRIM56，而不是TRIM56 （21AACC24）突变体，减少了PO（棕榈酸/油酸）诱导的脂质积累和TG升高（图1h）。此外，TRIM56 （21AACC24）不影响脂肪生成相关基因或蛋白的表达（图1i-j）。表明，TRIM56通过与FASN和共轭K48链的泛素化链相互作用来抑制肝细胞脂肪变性，
促进FASN的降解。

全文分享：【《J Clin Invest》解读：AI辅助药物发现！TRIM56通过泛素化修饰FASN来延缓NAFLD进展】。
如有相关科研问题，欢迎来询探讨。