结直肠癌(CRC)是全球癌症死亡的主要原因，研究表明微生物代谢物与结直肠癌密切相关，血液中的微生物代谢在结直肠癌和结直肠腺瘤(CRA)患者中都有显著的变化。然而，目前尚不清楚在腺瘤至腺癌癌变过程中，粪便和血液代谢组是如何改变的，以及血液循环中的代谢物是否会影响CRC的进展。
2024年8月，昆明医科大学第一附属医院团队联合香港中文大学团队、南京医科大学团队等共同在Cancer Cell（IF=48.8）上发表了题为“Integrative plasma and fecal metabolomics identify functional metabolites in adenoma-colorectal cancer progression and as early diagnostic biomarkers”的研究成果。通过代谢组学方法系统揭示了血浆代谢物作为结直肠癌（CRC）患者无创早期诊断标志物的潜力。采用Lip-MS技术，发现α-烯醇化酶（ENO1）是油酸的主要结合蛋白，FXR1是原胆酸的主要结合蛋白。为理解代谢物与受体的相互作用及其在结直肠癌中的功能提供了重要依据。
图形摘要：
Highlights如下：
1）在结直肠癌和结直肠腺瘤中发现血浆和粪便代谢产物的改变；
2）CRC富集油酸和CRC缺失别胆酸是CRC的关键代谢物；
3）代谢产物油酸或别胆酸结合肿瘤细胞受体调节下游的致癌途径；
4）血浆代谢物是CRC和腺瘤的潜在诊断生物标志物；
5）油酸或别胆酸分别促进或抑制CRC肿瘤的生长；
6）机制上，油酸或别胆酸分别直接结合ENO1或FXR1，以激活致癌性PI3K/Akt信号通路或导致结直肠癌中MAPK信号通路的失活，从而调节CRC的进展。
表达相关性：
血浆代谢组学：22种代谢物沿着腺瘤（CRA）-癌（CRC）进展依次富集，包括犬尿氨酸、二氢胸腺嘧啶和多种脂肪酸（如油酸）。在CRA和CRC中，包括别胆酸、L-组氨酸和脱氢表雄酮（DHEA）硫酸盐在内的34种代谢物依次减少。
粪便代谢组学：4种代谢物沿着腺瘤-癌进展依次富集，包括花生四烯酸、FAHFA等。在CRA和CRC中，包括迷迭香酸、香草酸在内的28种代谢物依次减少。
与化疗反应相关的代谢物：应答者中，雄甾酮硫酸盐、L-组氨酸和脱氢表雄酮硫酸盐的富集；促肿瘤生成的犬尿氨酸、氧化三甲胺和甘氨鹅脱氧胆酸的减少。
微生物组学：与CRC相关的致病共生菌——微小帕尔维菌、具核梭杆菌和肽链球菌属在NC-腺瘤-癌进展中持续富集，而毛螺菌科细菌、罗斯拜瑞氏菌属和粪杆菌属的等有益菌持续减少。
细胞因子分析：促炎细胞因子与CRC富集的代谢物呈正相关，或与CRC减少的代谢物呈负相关。相反，抗炎的IL-4和IL-13与CRC富集的代谢物呈负相关。根据CRC血浆、粪便差异富集途径构建代谢物与代谢通路的相关网络，分析显示CRC血浆和粪便代谢组中的差异代谢物主要与脂质代谢相关。
功能研究：油酸或别胆酸分别促进或抑制CRC肿瘤的生长。
机制研究：
（1）分别鉴定油酸或别胆酸的结合受体ENO1/FXR1
第一步，筛选油酸或别胆酸的互作分子
为了解代谢物如何作用于肿瘤细胞，对有或无油酸处理的细胞分别进行LiP-MS分析（一种表征代谢物与蛋白质之间相互作用和结合位点的方法）（图1a）。共鉴定出241个可能与油酸结合的蛋白肽，其中最显著的差异肽是ENO1（图1a-b）。分子对接分析表明，油酸通过烷基相互作用与ENO1的Arg49残基结合(平均结合能= −6.28 kcal/mol；图1c)，解离常数为10.6 μM（图1d）。
同样地，对有或无别胆酸处理的细胞分别进行LiP-MS分析（图1g），发现显著差异肽是FXR1（图1b）。分子对接分析表明，别胆酸通过氢键与FXR1的Arg70残基结合(平均结合能= -6.045 kcal/mol；图1h)，解离常数为32.9 μM（图1i）。
第二步，互作分子ENO1/FXR1功能验证
细胞学功能显示，敲减ENO1消除了油酸的致瘤作用（图1e），而ENO1拮抗剂AP-III-a4逆转了油酸诱导的细胞活力增加（图1f）。证实了ENO1是结直肠癌细胞中油酸的受体。
区别于油酸，CRISPR-Cas9敲除FXR1后，别胆酸显著丧失其抗肿瘤作用（图1j）。别胆酸的保护作用也被FXR1拮抗剂甘氨酸-β-苦胆酸所抵消（图1k）。表明，别胆酸对结直肠癌的保护作用依赖于FXR1。
图1 结直肠癌关键代谢物结合受体的鉴定（Ref. Fig 6）
（2）鉴定关键代谢物油酸或别胆酸改变的信号通路
为了探索油酸潜在的机制，对有或无油酸处理的细胞进行转录组测序，通路分析（KEGG和GSEA）发现PI3K/Akt是油酸诱导的最高富集通路（图2a），一致地，油酸处理细胞后增加磷酸化的JAK1、PI3K和AKT的蛋白表达，并且这种上调被ENO1-siRNA或ENO1拮抗剂AP-III-a4逆转（图2b）。在动物模型中，油酸增加PI3K/Akt通路标志蛋白的表达（图2c）。表明油酸与结直肠癌细胞中的ENO1结合，激活致癌PI3K/Akt信号通路。
同样地，对有或无别胆酸处理的细胞进行转录组测序，通路分析显示MAPK显著富集（图2d）。一致地，别胆酸显著降低MAPK通路标记物、细胞增殖（PCNA）和细胞周期（Cyclin D1）标记物的蛋白表达，而这种下调被FXR1- sgRNA或FXR1拮抗剂甘氨酸-β-胆酸逆转（图2e）。在动物模型中，别胆酸抑制MAPK通路蛋白的表达（图2f）。表明别胆酸与FXR1的结合导致了CRC中MAPK信号的失活。
图2 CRC中关键代谢物改变的信号通路的鉴定（Ref. Fig 7）
结论：研究者通过代谢组学分析，鉴定NC、CRA和CRC组粪便和血浆代谢标志物，尤其是沿着腺瘤-肿瘤方向的油酸富集和别胆酸消耗。功能上证实，油酸在CRC细胞系、患者来源的类器官（PDO）和小鼠CRC模型中表现出促肿瘤作用，而别胆酸具有相反的作用。机制上，油酸或别胆酸分别与结直肠癌细胞中的ENO1或FXR1直接结合，激活PI3K/Akt信号通路或抑制MAPK信号通路，从而调控癌症进展。此外，研究团队还比较了粪便代谢物和血浆代谢物的临床潜力，发现后者具有更好的诊断性能。
2024年8月，昆明医科大学第一附属医院团队联合香港中文大学团队、南京医科大学团队等共同在Cancer Cell（IF=48.8）上发表了题为“Integrative plasma and fecal metabolomics identify functional metabolites in adenoma-colorectal cancer progression and as early diagnostic biomarkers”的研究成果。通过代谢组学方法系统揭示了血浆代谢物作为结直肠癌（CRC）患者无创早期诊断标志物的潜力。采用Lip-MS技术，发现α-烯醇化酶（ENO1）是油酸的主要结合蛋白，FXR1是原胆酸的主要结合蛋白。为理解代谢物与受体的相互作用及其在结直肠癌中的功能提供了重要依据。
图形摘要：
Highlights如下：
1）在结直肠癌和结直肠腺瘤中发现血浆和粪便代谢产物的改变；
2）CRC富集油酸和CRC缺失别胆酸是CRC的关键代谢物；
3）代谢产物油酸或别胆酸结合肿瘤细胞受体调节下游的致癌途径；
4）血浆代谢物是CRC和腺瘤的潜在诊断生物标志物；
5）油酸或别胆酸分别促进或抑制CRC肿瘤的生长；
6）机制上，油酸或别胆酸分别直接结合ENO1或FXR1，以激活致癌性PI3K/Akt信号通路或导致结直肠癌中MAPK信号通路的失活，从而调节CRC的进展。
表达相关性：
血浆代谢组学：22种代谢物沿着腺瘤（CRA）-癌（CRC）进展依次富集，包括犬尿氨酸、二氢胸腺嘧啶和多种脂肪酸（如油酸）。在CRA和CRC中，包括别胆酸、L-组氨酸和脱氢表雄酮（DHEA）硫酸盐在内的34种代谢物依次减少。
粪便代谢组学：4种代谢物沿着腺瘤-癌进展依次富集，包括花生四烯酸、FAHFA等。在CRA和CRC中，包括迷迭香酸、香草酸在内的28种代谢物依次减少。
与化疗反应相关的代谢物：应答者中，雄甾酮硫酸盐、L-组氨酸和脱氢表雄酮硫酸盐的富集；促肿瘤生成的犬尿氨酸、氧化三甲胺和甘氨鹅脱氧胆酸的减少。
微生物组学：与CRC相关的致病共生菌——微小帕尔维菌、具核梭杆菌和肽链球菌属在NC-腺瘤-癌进展中持续富集，而毛螺菌科细菌、罗斯拜瑞氏菌属和粪杆菌属的等有益菌持续减少。
细胞因子分析：促炎细胞因子与CRC富集的代谢物呈正相关，或与CRC减少的代谢物呈负相关。相反，抗炎的IL-4和IL-13与CRC富集的代谢物呈负相关。根据CRC血浆、粪便差异富集途径构建代谢物与代谢通路的相关网络，分析显示CRC血浆和粪便代谢组中的差异代谢物主要与脂质代谢相关。
功能研究：油酸或别胆酸分别促进或抑制CRC肿瘤的生长。
机制研究：
（1）分别鉴定油酸或别胆酸的结合受体ENO1/FXR1
第一步，筛选油酸或别胆酸的互作分子
为了解代谢物如何作用于肿瘤细胞，对有或无油酸处理的细胞分别进行LiP-MS分析（一种表征代谢物与蛋白质之间相互作用和结合位点的方法）（图1a）。共鉴定出241个可能与油酸结合的蛋白肽，其中最显著的差异肽是ENO1（图1a-b）。分子对接分析表明，油酸通过烷基相互作用与ENO1的Arg49残基结合(平均结合能= −6.28 kcal/mol；图1c)，解离常数为10.6 μM（图1d）。
同样地，对有或无别胆酸处理的细胞分别进行LiP-MS分析（图1g），发现显著差异肽是FXR1（图1b）。分子对接分析表明，别胆酸通过氢键与FXR1的Arg70残基结合(平均结合能= -6.045 kcal/mol；图1h)，解离常数为32.9 μM（图1i）。
第二步，互作分子ENO1/FXR1功能验证
细胞学功能显示，敲减ENO1消除了油酸的致瘤作用（图1e），而ENO1拮抗剂AP-III-a4逆转了油酸诱导的细胞活力增加（图1f）。证实了ENO1是结直肠癌细胞中油酸的受体。
区别于油酸，CRISPR-Cas9敲除FXR1后，别胆酸显著丧失其抗肿瘤作用（图1j）。别胆酸的保护作用也被FXR1拮抗剂甘氨酸-β-苦胆酸所抵消（图1k）。表明，别胆酸对结直肠癌的保护作用依赖于FXR1。
图1 结直肠癌关键代谢物结合受体的鉴定（Ref. Fig 6）
（2）鉴定关键代谢物油酸或别胆酸改变的信号通路
为了探索油酸潜在的机制，对有或无油酸处理的细胞进行转录组测序，通路分析（KEGG和GSEA）发现PI3K/Akt是油酸诱导的最高富集通路（图2a），一致地，油酸处理细胞后增加磷酸化的JAK1、PI3K和AKT的蛋白表达，并且这种上调被ENO1-siRNA或ENO1拮抗剂AP-III-a4逆转（图2b）。在动物模型中，油酸增加PI3K/Akt通路标志蛋白的表达（图2c）。表明油酸与结直肠癌细胞中的ENO1结合，激活致癌PI3K/Akt信号通路。
同样地，对有或无别胆酸处理的细胞进行转录组测序，通路分析显示MAPK显著富集（图2d）。一致地，别胆酸显著降低MAPK通路标记物、细胞增殖（PCNA）和细胞周期（Cyclin D1）标记物的蛋白表达，而这种下调被FXR1- sgRNA或FXR1拮抗剂甘氨酸-β-胆酸逆转（图2e）。在动物模型中，别胆酸抑制MAPK通路蛋白的表达（图2f）。表明别胆酸与FXR1的结合导致了CRC中MAPK信号的失活。
图2 CRC中关键代谢物改变的信号通路的鉴定（Ref. Fig 7）
结论：研究者通过代谢组学分析，鉴定NC、CRA和CRC组粪便和血浆代谢标志物，尤其是沿着腺瘤-肿瘤方向的油酸富集和别胆酸消耗。功能上证实，油酸在CRC细胞系、患者来源的类器官（PDO）和小鼠CRC模型中表现出促肿瘤作用，而别胆酸具有相反的作用。机制上，油酸或别胆酸分别与结直肠癌细胞中的ENO1或FXR1直接结合，激活PI3K/Akt信号通路或抑制MAPK信号通路，从而调控癌症进展。此外，研究团队还比较了粪便代谢物和血浆代谢物的临床潜力，发现后者具有更好的诊断性能。
